Uji Reaktivitas Secara Biologi In-Vitro

Uji Reaktivitas Secara Biologi In-Vitro

Uji berikut dirancang untuk menentukan reaktivitas biologik biakan sel mamalia setelah kontak dengan plastik elastomer dan bahan polimer lain yang kontak dengan penderita secara langsung atau tidak langsung, atau dengan ekstraks khusus yang di buat dari bahan uji. Hal yang penting adalah menyediakan luas permukaan spesifik untuk ekstraksi. Jika luas permukaan specimen tidak dapat ditentukan, gunakan 0,1 g elastomer atau 0,2 g plastik atau bahan lain untuk setiap ml cairan ekstraksi. Juga penting berhati-hati dalam penyediaan bahan-bahan tersebut untuk menghindari kontaminasi mikroba dan zat asing lain.

Tiga uji diuraikan di bawah ini: Uji Difusi Agar, Uji Kontak langsung, dan Uji Eluasi. Keputusan jenis uji atau jumlah uji yang dilakukan untuk menilai respons biologic potensial sampel atau ekstrak khusus tetgantung dari bahan, produk akhir dan tujuan penggunaan. Faktor lain yang mungkin juga mempengaruhi kesesuaian: sampel untuk suatu penggunaan khusus adalah komposisi polimer: prosedur pembuatan dan pembersihan; media kontak; tinta; perekat; absorbs, adsorbsi dan permeabilitas pengawet; dan kondisi penyimpana. Evaluasi terhadap faktor tersebut harus dilakukan dengan berbagai uji khusus tambahan sebelum menentukan bahwa produk yang dibuat dari suatu bahan khusus tepat untuk tujuan penggunaannya.

Baku pembanding Bioreaksi Negatif BPFI; Bioreaksi Positif Padat BPFI; Ekstrak Positif BPFI.

Penyiapan Biakan Sel Buat biakan ganda sel fibroblast mamalia L-929 (ATCC cell line CCL 1, NCTC klon 929) dalam media esensial minimum yang ditambah serum dan mempunyai kerapatan benih lebih kurang 10⁵ sel per ml. inkubasi biakan pada suhu 37^o+1^o selama tidak kurang 24 jam dalam atmosfer karbon dioksida 5%+1%, sampai diperoleh lapisan tunggal sel dan kompak lebih dari 80%. Periksa dibawah mikroskop untuk memastikan biakan merupakan lapisan tunggal seragam dan hampir kompak. (Catatan Reprodusibilitas Uji Reaktivitas secara Biologi in-Vitro tergantung pada kerapatan biakan sel yang seragam).

Pelarut ekstraksi Injeksi Natrium Klorida seperti yang tertera pada Injeksi Natrium Klorida mengandung natrium klorida 0,9%. Sebagai pengganti, dapat digunakan media biakan sel mamalia bebas serum atau media biakan sel mamalia yang ditambah serum. Penambahan serum digunakan bila ekstraksi dilakukan pada suhu 37^o selama 24 jam.

Otoklaf Gunakan otoklaf yang dapat mempertahankan suhu 121^o+ 2^o, dilengkapi dengan thermometer, pengukur tekanan, lubang ventilasi, rak yang cukup untuk menampung wadah uji di atas permukaan air dan sistem pendingin air yang akan mendinginkan wadah uji sampai suhu lebih kurang 20^o, tetapi tidak dibawah suhu 20^o,segera setelah siklus pemanasan.

Incubator Gunakan incubator yang dapat mempertahankan suhu 37^o +1^o dan atmosfer karbon dioksida dalam udara 5%+ 1%. (Catatan bila digunakan tabung biakan tertutup, atmosfer karbon dioksida dalam incubator tidak diperlukan).

Wadah untuk ekstraksi Gunakan hanya wadah seperti ampul atau tabung biakan tertutup alir, atau yang setara, yang terbuat dari kaca Tipe L. Bila digunakan tabung baiakan, atau yang setara, bertutup alir berlapis elastomer yang sesuai, seluruh permukaan lapisan elastomerbyang terpapar dilindungi dengan cakram padat inert setebal 0,05 mm hingga 0,075 mm. Cakram yang sesuai dapat dibuat dari politetraflouroetilen (politef).

Penyiapan alat Bersihkan semua alat gelas dengan campuran pembersih asam kromat, bila perlu dengan asam nitrat panas, kemudian dibilas dengan air untuk Injeksi P. Sterilkan wadah dan alat yang digunakan untuk ekstraksi, pemindahan, atau pemberian bahan uji dan keringkan dengan cara yang sesuai. Bila etilen oksida digunakan untuk sterilisasi, biarkan tidak kurang dari 43 jam untuk pengawaudaraan yang sempurna.

Prosedur

Penyiapan sampel untuk ekstrak Lakukan prosedur seperti yang tertera pada Uji Reaktivitas secara Biologi, in-vivo.

Penyiapan Ekstrak Lakukan penyiapan ekstrak seperti yang tertera pada Penyiapan ekstrak dalam Uji Reaktivitas scara Biologi in-vivo, menggunakan larutan Injeksi Natrium Klorida (natrium klorida 0,9 %) atau media biakan sel mamalia bebas serum sebagai Pelarut ekstraksi. (Catatan Bila ekstraksi dilakukan pada suhu 37^oselama 24 jam, dalam incubator, gunakan media biakan sel yang ditambah serum. Kondisi ekstraksi tidak boleh menyebabkan perubahan fisik seperti fusi atau pelelehan potongan beban kecusali sedikit perlengketan).

Uji Difusi Agar

Uji ini dirancang untuk tutup elastomer dalam berbagai bentuk. Lapisan agar berlaku sebagai bantalan untuk melindungi sel dari kerusakan mekanis dan sebagai sarana difusi bagi bahan kimia yang dapat terlepas dari specimen polimer. Ekstrak bahan uji diletakkan di atas selembar kertas saring.

Sampel Gunakan ekstrak yang telah dibuat seperti yang telah disebut atau gunakan bagian dari specimen uji yang mempunyai permukaan datar dengan luas permukaan tidak kurang dari 100 mm².

Prosedur Dengan menggunakan 7 ml suspensi sel yang dibuat seperti yang tertera pada Penyiapan Biakan Sel, buat lapisan tunggal biakan sel pada lempeng berdiameter 60 mm. setelah inkubasi, buang media biakan dari lapisan tunggal dengan pipet, dan ganti dengan media biakan yang ditambah serum dan mengandung agar P tidak lebih dari 2 %. [Catatan mutu agar harus cukup baik untuk menunjang pertumbuhan sel. Lapisan agar harus cukup tipis sehingga bahan kimia yang terlepas dapat terdifusi]. Tempelkan permukaan di atas Sampel, Bioreaksi Negatif BPFI (sebagai control negative), dan Ekstrak Bioreaksi Positif BPFI (sebagai control positif) dalam biakan rangkap dua pada permukaan agar yang telah memadat. Gunakan tidak lebih dari 3 spesimen per lempeng. Inkubasi semua biakan pada suhu 37^o + 1^o selama tidak kurang dari 24 jam, sebaiknya dalam incubator lembab yang mengandung karbon dioksida 5 %+1%. Amati masing-masing biakan pada tiap Sampel, Kontrol negatif, dan kontrol positif, di bawah mikroskop, bila perlu dengan menggunakan pewarna sitokimia.

Interpretasi hasil Reaktivitas Biologik (degenerasi dan malformasi sel) digambarkan dan diberi skala 0 sampai 4 (seperti tertera pada Tabel 1). Ukur respons yang diperoleh dari Kontrol negatif dan Kontrol Positif. Sistem uji ini sesuai bila respons yang diamati sesuai dengan derajat reaktivitas biologik yang tertera pada penandaan baku pembanding. Ukur respons yang diperoleh dari Sampel. Sampel memenuhi persyaratan uji bila tidak satupun biakan sel yang terpapar terhadap Sampel menunjukkan reaktivitas lebih besar dari reaktivitas ringan (Tingkat 2). Ulangi uji ini bila tidak ada kesesuaian sistem.

Uji Kontak Langsung

Uji ini dirancang untuk bahan dalam berbagai bentuk. Prosedur memungkinkan ekstraksi bersamaan dan pengujian bahan kimia yang dapat lepas dari specimen dengan media yang ditambah serum. Prosedur ini tidak sesuai untuk bahan dengan kerapatan sangat rendah atau sangat tinggi yang dapat menyebabkan kerusakan mekanis pada sel.

Sampel Gunakan bagian dari specimen uji yang mempunyai permukaan datar dengan luas permukaan tidak kurang dari 100 mm².

Prosedur Dengan menggunakan 2 ml suspensi sel yang dibuat seperti yang tertera pada Penyiapan Biakan Sel, buat lapisan tunggal biakan sel pada lempeng berdiameter 35 mm. Setelah inkubasi, buang media biakan dari lapisan tunggal dengan pipet, dan ganti dengan media biakan 0,8 ml biakan segar, Tempatkan Sampel tunggal, Bioreaksi Negatif BPFI (sebagai kontrol negatif), dan Bioreaksi Positif BPFI (sebagai kontrol positif) masing-masing biakan rangkap dua. Inkubasi semua biakan pada suhu 37^o + 1^o selama tidak kurang dari 24 jam dalam incubator yang lembab, sebaiknya mengandung karbon dioksida 5 %+1%. Amati setiap biakan pada tiap Sampel, Kontrol negatif, dan kontrol positif, secara visual atau dengan mikroskop bila perlu menggunakan pewarna sitokimia.

Interpretasi hasil Lakukan sesuai yang tertera pada Interpretasi hasil biakan yang diperlakukan dengan sampel menunjukkan lebih dari . reaktivitas ringan (Tingkat 2). Ulangi uji ini bila tidak ada kesesuaian sistem.

Tabel 1. Tingkatan Reaktivitas untuk Uji Difusi Agar dan Uji Kontak Langsung

Tingkat	Reaktivitas	Pemerian Daerah Reaktivitas
0	Tidak Ada	Tidak ditemukan daerah reaktivitas sekitar dan di bawah spesimen
1	Sedikit	Beberapa sel dengan malformasi dan degenerasi di bawah specimen
2	Ringan	Daerah reaktivitas terbatas pada daerah di bawah spesimen
3	Sedang	Daerah resktivitas meluas 0,5 cm sampai 1,0 cm di luar specimen
4	Berat	Daerah reaktivitas meluas lebih dari 1,0 cm di luar specimen tetapi tidak sampai seluruh cawan

Uji Eluasi

Uji ini dirancang untuk mengevaluasi ekstrak bahan polimer. Prosedur memungkinkan ekstraksi specimen pada suhu fisiologik atau non fisiologik untuk berbagai interval waktu. Uji ini sesuai untuk bahan dengan kerapatan tinggi dan untuk evaluasi dosis-respons.

Sampel Lakukan seperti yang tertera pada Penyiapan ekstrak, Injeksi Natrium Klorida (natrium klorida 0,9 %) atau media biakan sel mamalia bebas serum sebagai Pelarut ekstraksi. Bila sampel tidak dapat dengan mudah diukur, dapat digunakan tidak kurang dari 0,1 g bahan elastomer atau 0,2 g plastik atau bahan polimer per ml media ekstraksi. Sebagai cara lain, gunakan media biakan sel mamalia yang ditambah serum sebagai media ekstraksi untuk lebih mendekati kodisi fisiologis. Buat ekstrak dengan memnaskan selama 24 jam dalam inkubator yang sebaiknya mengandung karbon dioksida 5%+1%. Pertahankan suhu ekstraksi pada 37^o+1^o, Karen suhu yang lebih tinggidapat menyebabkan denaturasi protein serum.

Prosedur dengan menggunakan 2 ml suspensi sel yang dibuat seperti yang tertera pada penyiapan biakan sel, buat lapisan tunggal pada lempeng berdiameter 35 mm. Setelah inkubasi, buang media biakan dari lapisan tunggal dengan pipet dan ganti dengan ekstrak sampel, Bioreaksi Negatif BPFI (sebagai Kontrol Negatif), atau Ekstrak Bioreaksi Positif BPFI (sebagai Kontrol Positif). Ekstrak yang dibuat dengan media biakan sel yang bebas serum maupun yang ditambah serum diuji rangkap dua tanpa pengenceran (100%). Ekstrak larutan Injeksi Natrium Klorida diencerkan dengan media biakan sel yang ditambah dengan serum dan diuji rangkap dua pada kadar ekstrak 25%. Inkubasi semua biakan pada suhu 37^o+1^o selama 48 jam dalam Inkubator yang sebaiknya mengandung karbon dioksida 5%+1%. Periksa setiap biakan pada 48 jam, dibawah mikroskop, jika perlu menggunakan pewarna sitokimia.

Interpretasi Hasil Lakukan seperti yang tertera pada Interpretasi Hasil pada Uji Difusi Agar, tetapi gunakan Tabel 2. Ulangi uji bila tidak ada kesesuaian sistem. Sampel memenuhi persyaratan uji bila biakan yang diperlakukan dengan Sampel menunjukkan reaksivitas ringan (Tingkat 2). Bila biakan yang diperlakukan dengan Sampel menunjukan reaktivitas yang lebih besar secara bermakna dibandingkan biakan yang diberi Kontrol negatif, ualngi uji dengan mengenceran ekstrak secara kuantitatif.

Tabel 2. Tingkatan Reaktivitas untuk Uji Elusi

Tingkat	Reaktivitas	Pemerian Daerah Reaktivitas
0	Tidak Ada	Granul intrasitoplasmik yang terpisah; tidak ada lisis sel
1	Sedikit	Tidak lebih dar 20% sel bulat, hamper lepas dan tanpa granul intrasitoplasmik; bnayak sel lisis dan daerah kosong di antara sel
2	Ringan	Tidak lebih dari 50% sel bulat dan tanpa granul intrasitoplasmik; banyak sel lisis dan derah kosong diantara sel
3	Sedang	Tidak lebih dari 70% lapisan sel mengandung sel bulat dan/ tidak lisis
4	Berat	Kerusakan lapisan sel hamper menyeluruh