Uji Reaktivitas Secara Biologi In-Vivo

Uji Reaktivitas Secara Biologi In-Vivo

Uji berikut dirancang untuk menentukan respons biologk hewan terhadap plastik elastomer dan bahan polimer lain yang kontak dengan penderita secara langsung atau tidak langsung, atau dengan penyuntikkan ekstrak khusus yang dibuat dari bahan uji. Hal yang penting yaitu menyediakan daerah permukaan spesifik untuk ekstraksi. Jika daerah permukaan specimen tidak dapat ditentukan, gunakan 100 mg elastomer atau 200 mg plastik atau bahan lain untuk setiap ml cairan ekstraksi. Juga penting untuk berhati-hati dalam penyediaan bahan-bahan yang akan disuntikkan atau diteteskan guna menghindari kontaminasi mikroba dan zat asing lain.
Empat uji diuraikan dibawah ini. Uji injeksi sistemik dan uji intrakutan digunakan bahan elastomer, terutama untuk tutup elastomer dengan uji reaktivitas secara biologi in-vitro yang sesuai telah menunjukkan reaktivitas biologi yang bermakna. Kedua uji ini digunakan untuk plastic dan polimer lain di samping uji ketiga, uji implantasi, yaitu untuk menguji kesesuaian bahan yang dimaksudkan untuk penggunaan dalam pembuatan wadah dan kelengkapannya, untuk penggunaan dalam sediaan parenteral, alat kesehatan, implantasi dan system lain.
Uji keempat Uji Iritasi Mata digunakan untuk wadah dan alat kesehatan yang digunakan untuk mata dari plastic dan bahan polimer lain. Uji ini meliputi penetesan ekstrak bahan uji kedalam mata kelinci dan membandingkan efekya dengan mata kelinci yang ditetesi air untuk injeksi P.
Dalam hal ini berlaku definisi berikut: sampel adalah specimen yang di uji atau ekstrak yang di buat dari specimen tersebut. Blanko terdiri dari media ekstraksi yang sama dalam jumlah yang sama dengan yang digunakan untuk mengekstraksi specimen yang diuji, yang diperlakukan dengan cara yang sama seperti media ekstraksi yang mengandung specimen uji. Control negative adalah specimen yang tidak memberikan reaksi pada kondisi uji.
Klasifikasi plastik. Plastik diklasifikasikan menjadi 6 kelas seperti pada table 1. Klasifikasi berdasarkan respons terhadap serangkaian uji in-vivo yang ditetapkan untuk berbagai ekstrak, bahan dan cara pemberiaan. Uji ini berhubungan langsung dengan penggunaan akhir wadah plastik. Cairan ekstrak yang dipilih mewakili pembawa dalam sediaan yang akan kontak dengan plastik tersebut, klasifikasi dalam Tabel 1 memberikan informasi untuk pemasok, pemakai dan pabrik plastik, berupa ringkasan uji yang ditentukan oleh FI untuk wadah injeksi dan alat kesehatan.
Kecuali untuk uji implantasi, prosedur berdasarkan penggunaan ekstrak yang bergantung pada daya tahan bahan terhadap panas, dilakukan pada salah satu dari 3 suhu yaitu 50o, 70o, dan 121o. Oleh karena itu penandaan kelas plastik harus dengan disertai dengan suhu ekstraksiny; misalnya IV – 121o; yang menunujukkan kelas IV yang diekstraksi pada suhu 121o; atau I – 50o, yang menunjukkan plastic kelas I yang diekstraksi pada suhu 50o. Uji yang tertera pada uji reaktivitas secara Biologi in-vitro dapat berguna sebagai sarana penapisan untuk mengeluarkan bahan yang tidak dapat diterima. Akan tetapi plastik dapat diklasifikasikan sebagai plastic BPFI Kelas I sampai kelas VI apabila didasarkan pada criteria respons yang ditentukan dalam Tabel 1.

Klasifikasi ini tidak berlaku untuk plastik yang dimaksudkan untuk wadah sedian oral atau topikal, atau yang mungkin digunakan sebagai bagian dari formulasi obat. Tabel 1 tidak berlaku untuk elastomer alamiah yang harus di uji dalam Injeksi Natrium Klorida dan Minyak Nabati saja.
Uji Injeksi Sistemik dan Uji Intrakutan masing-masing dirancang untuk menentukan respons biologik sistemik dan lokal hewan terhadap plastik dan polimer lain dengan penyuntikan dosis tunggal ekstrak khusus yang disiapkan dari Sampel. Uji Implantasi dirancang untuk menilai reaksi jaringan hidup terhadap plastik dan polimer lain dengan implantasi Sampel ke dalam jaringan hewan. Persiapan yang tepat dan penempatan spesimen secara aseptik penting dalam melaksanakan Uji Implantasi.
Semua uji dirancang untuk plastik dan polimer lain dalam kondisi penggunaannya masing-masing. Bila bahan akan mengalami proses pencucian atau strerilisasi sebelum menggunakan akhir, maka uji harus dilakukan pada Sampel yang dibuat dari spesimen yang telah mengalami proses sama.
Faktor seperti komposisi bahan, prosedur pembuatan dan pembersihan, media kontak, tinta, perekat, absorbsi, adsorbsi dan permeabilitas pengawet dan kondisi penyimpanan mungkin juga mempengaruhi kesesuaian suatu bahan untuk penggunaan tertentu. Evaluasi terhadap faktor tersebut harus dilakukan dengan berbagai uji khusus tambahan yang sesuai sebelum menentukan kesesuaian bahan untuk tujuan penggunaannya.
Media Ekstraksi Injeksi Natrium Klorida seperti yang tertera pada monografi. Gunakan Injeksi natrium klorida P 0,9%.
Larutan alkohol P 1 dalam 20 dalam larutan Injeksi Natrium Klorida.
Polictileit Glikol 400.
Minyak Nabati Gunakan Oleum sesame yang baru dimurnikan. Oleum Lini atau minyak nabati lain yang sesuai.
Pembawa sediaan obat (jika perlu).
Air untuk Injeksi P.
[Catatan Oleum Sesami, Oleum Lini atau minyak nabati lain yang sesuai memenuhi persyaratan tambahan berikut:
Siapkan bahan bila mungkin minyak yang baru dimurnikan. Suntik secara intrakutan tiga ekor kelinci yang telah disiapkan dengan minyak tersebut dengan dosis 0,2 ml pada masing-masing 10 tempat per hewan, dan amati pada 24 jam, 48 jam, dn 72 jam setelah suntikan. Berikan skor penilaian seperti yang tertera pada Tabel 5 disetiap tempat suntikan. Untuk 3 ekor kelinci (30 tempat suntikan), pada setiap waktu pengamatan, respons rata-rata berupa eritema tidak boleh lebih besar dari 0,5 dan berupa edema yang tidak boleh besar dari 1,0, dan tidak satu tempatpun yang memperlihatkan diameter reaksi jaringan lebih dari 10 mm. Residu minyak di tempat penyuntikan tidak boleh disalah-artikan sebagai edema. Jaringan yang mengalami edema akan memutih bila ditekan pelan-pelan.]

Alat
Otoklaf Gunakan otoklaf yang dapat mempertahankan suhu 121o+2,0o dilengkapi dengan thermometer, pengukur tekanan, lubang ventilasi, rak yang cukup untuk menmpung wadah uji diatas permukaan air dan sistem pendingin air yang akan mendinginkan wadah uji sampai suhu lebih kurang 20o, tetapi tidak di bawah suhu 20o, segera setelah siklus pemanasan.
Oven Gunakan oven, sebaiknya model sirkulasi paksa yang akan mempertahankan suhu kerja 50o atau 70o dalam kisaran +20o.
Wadah Ekstraksi Gunakan hanya wadah seperti ampul atau lubang biakan tertutup ulir yang terbuat dari kaca Tipe 1. Bila digunakan tabung biakan bertutup ulir berlapis elastomer yang terpapar dilindungi dengan piringan padat netral setebal 0,05 mm hingga 0,075 mm. Piringan yang sesuai dapat dibuat dari resin politetraflouroetilen (politef).
Persiapan Alat Bersihkan semua alat gelas dengan campuran pembersih asam kromat, atau jika perlu dengan asam nitrat panas, kemudian dibilas dengan air. Bersihkan alat pemotong dengan cara yang sesuai (misalnya bersihkan berturut-turut dengan aseton dan metilena klorida) sebelum digunakan untuk membagi spesimen. Bersihkan alat-alat dengan mengosok dengan detergen yang sesuai dan bilas dengan air. Sterilkan wadah dan alat yang digunakan untuk ekstraksi, pemindahan, pemberian bahan uji, kemudian keringkan dengan cara yang sesuai.[Catatan Bila digunakan etilen oksida untuk sterilisasi, diperlukan jangka waktu yang cukup untuk menghilangan gas dengan sempurna.]
Prosedur Penyiapan Sampel Uji Injeksi Sistemik dan Uji Intrakutan dapat dilakukan dengan menggunakan ekstrak yang sama, atau dibuat ekstrak yang terpisah untuk masing-masing uji. Pilih dan bagi menjadi bagian-bagian Sampel dengan ukuran seperti tertera dalam Tabel 2. Buang partikel seperti serat dan partikel bebas dengan memperlakukan setiap bagian Sampel atau Kontrol Negatif dengan cara sebagai berikut :
Masukan Sampel ke dalam labu ukur 100 ml bertutup kaca yang terbuat dari kaca Tipe 1, dan tambahkan lebih kurang 70 ml air untuk Injeksi P. kocok selama kurang lebih 30 detik dan buang airnya, ulangi pencucian dan keringkan potongan sampel untuk ekstraksi dengan Minyak Nabati dalam oven pada suhu tidak lebih 50o. [Catatan Tidak boleh membersihkan Sampel dengan kain kering atau basah atau dengan membilas atau dengan mencuci dengan pelarut organik, surfaktan, dsb.]
Penyiapan Ekstrak Masukkan Sampel uji yang telah disiapkan ke dalam wadah ekstraksi dan tambahkn 20 ml media ekstraksi yang sesuai. Ulangi cara ini untuk setiap media ekstraksi yang diperlukan untuk uji. Juga siapkan 20 ml blangko setiap media untuk penyuntikan paralel dan dengan cara yang sama sebagai pembanding. Ekstraksi dengan memanaskan dalam otoklaf pada suhu 121o selama 60 menit, dalam oven pada suhu 70o selama 24 jam, atau pada suhu 50o selama 72 jam. Biarkan cairan dalam wadah beberapa lama untuk mencapai suhu ekstraksi.
[Catatan Kondisi ekstrak tidak boleh menyebabkan perubahan fisik seperti fusi atau lelehnya potongan Sampel, yang menyebabkan berkurangnya luas permukaan yang tersedia. Sedikit perlengketan antara potongan sampel dapat diterima. Masukkan potongan yang telah dibersihkan satu per satu ke dalam media. Bila digunakan tabung biakan bertutup ulir untuk ektrasi dalam otoklaf dengan Minyak Nabati, tutup ulir harus cukup rapat dengan pita peka tekanan.]
Dinginkan sampai kira-kira suhu kamar tetapi tidak kurang dari 20o, kocok kuat selama beberapa menit dan segera enaptuangkan setiap ekstrak secara aseptik ke dalam wadah kering dan steril. Simpan ekstrak pada suhu antara 20o dan 30o, dan jangan digunakan untuk uji setelah lebih dari 24 jam. Hal yang penting adalah kontak antara media ekstraksi dengan daerah permukaan plastik yang tersedia, waktu, dan suhu selama ekstraksi, pendinginan yang semestinya, pengocokan dan proses enap tuang, dan penanganan aseptik serta penyimpanan ekstrak setelah ekstraksi
Uji Injeksi Sistemik
Uji ini dirancang untuk menilai respons sistemik terhadap ekstrak bahan uji setelah disuntikan pada mencit.
Hewan Uji Gunakan mencit putih sehat dan belum pernah digunakan sebelumnya, bobot tubuh antara 17 g dan 23 g. Untuk setiap kelompok uji gunakan mencit dari sumber yang sama. Air dan makanan yang biasa digunakan untuk hewan percobaan laboratorium dengan komposisi yang telah diketahui, diberikan secukupnya.
Prosedur [Catatan Kocok kuat-kuat setiap ekstrak sebelum disuntikan, untuk memastikan bahwa bahan yang terekstraksi terbagi rata. Akn tetapi, partikel yang terlihat tidak boleh disuntikan secara intravena.] Suntik masing-masing 5 ekor mencit dari kelompok uji dengan Sampel atau Blangko seperti tertera pada Tabel 3, kecuali untuk setiap gram ekstrak Sampel yang dibuat dengan Polietilen Glokol 400 dan blangko, encerkan dengan 4,1 bagian volume Larutan Injeksi Natrium Klorida untu memperoleh larutan dengan kadar lebih kurang 200 mg polietilen glikol per ml.
Amati hewan uji setelah penyuntikan, setelah 4 jam, dan kemudian sekurang-kurangnya setelah 24 jam, 48 jam dan 72 jam. Bila selama masa observasi tidak satupun di antara hewan yang diberi ekstrak Sampel menunjukkan reaktivitas biologik yang lebih besar secara signifikasi disbanding hewan yang memperoleh Blangko, maka Sampel memenuhi persyaratan uji. Bila 2 ekor atau lebih mencit mati, atau bila terlihat perilaku abnormal seperti konvulsi atau prostrasi pada 2 ekor mencit atau lebi, atau bila terjadi penurunan bobot tubuh lebih dari 2 kg pada 3 ekor mencit atau lebih, maka Sampel tidak memenuhi persyaratan uji. Bila hewan yang diberi Sampel ada yang memperlihatkan sedikit tanda-tanda reaktivitas biologic dan tidak lebih dari 1 ekor hewan memperlihatkan gejala reaktivitas biologic yang nyata atau mati, ulangi uji dengan menggunakan kelompok yang terdiri dari 10 ekor mencit. Pada uji ulang, ke 10 ekor hewan yang diberi Sampel tidak boleh mempelihatkan reaktivitas biologic yang lebih besar secara signifikasi di banding hewan yang diberi Balngko selama periode pengamatan.

Uji Intrakutan
Uji ini dirancang untuk menilai respons lokal terhadap ekstrak bahan uji setelah penyuntikan intrakutan pada kulit kelinci.
Hewan Uji Pilih kelinci albino sehat dan berkulit tipis yang bulunya dapat dicukur pendek dan kulitnya bebas dari iritasi mekanis atau trauma. Dalam memperlakukan hewan uji, tempat penyuntikan jangan disentuh selama waktu pengamatan, kecuali untuk membedakan antara edema dan residu minyak. [Catatan Kelinci yang sebelumnya digunakan untuk uji yang tidak berhubungan, misalnya Uji Pirogen <231>, dan yang telah mendapat masa istirahat yang ditentukan, boleh digunakan untuk uji ini asal kulitnya bersih dan tidak cacat.]
Prosedur [Catatan Kocok kuat-kuat setiap ekstrak sebelum disuntikan, untuk memastikan bahwa bahan yang terekstraksi terbagi rata.] Pada uji ukur, cukur bulu bagian punggung hewan uji ke dua sisi tulang belakang hingga diperoleh daerah uji yang cukup. Hindari iritasi mekanis dan trauma. Bersihkan rambut yang lepas dengan pompa hisap. Bila perlu seka kulit dengan alkohol encer dan keringkan sebelum disuntik. Lebih dari satu ekstrak dari bahan tertentu dapat digunakan untuk tiap ekor kelinci, bila telah dipastikan bahwa hasil uji tidak akan dipengaruhi. Untuk setiap Sampel gunakan 2 ekor hewan dan suntik masing-masing hewan secara intrakutan dengan menggunakan satu sisi hewan untuk Sampel dan sisi lainnya untuk Blangko, seperti tertera pada Tabel 4.


Tabel 5. Penilaian Reaksi Kulit

Amati tempat penyuntikan terhadap adanya reaksi jaringan seperti eritema, edema, dan nekrosis. Bila perlu, seka kulit perlahan-lahan dengan alkohol enceruntuk membantu pengamatan. Amati semua hewan pada 24 jam, 48 jam, dan 72 jam setelah penyuntikan. Berikan skor penilaian untuk ekstrak Sampel dan Blangko. Seperti yang tertera pada Tabel 5. Bila perlu cukur kembali bulu selama pengamatan. Skor rata-rata eritema dan edema untuk tempat Sampel dan Blangko ditentukan pada setiap interval penilaian (24 jam, 48 jam, dan 72 jam) untuk setiap ekor kelinci. Setelah penilain 72 jam, semua skor eritema ditambah skor edema dijumlah untuk masing-masing Sampel dan Blangko. Bagi masing-masing jumlah dengan 12 (2 hewan x 3 waktu penilaian x 2 kategori penilaian)untuk menentukan skor rata-rata keseluruhan untuk setiap Sampel versus setiap Blangko. Persyaratan uji dipenuhi bila perbedaan skor rata-rata antara Sampel dan Blangko tidak lebih dari 1,0. Bila perlu pengamatan reaksi rata-rata Sampel lebih besar secara meragukan dari reaksi rata-rata Blangko, ulangi uji dengan menggunakan 3 ekor kelinci tambahan. Persyaratan uji dipenuhi bila perbedaan skor rata-rata antara Sampel dan Blangko tidak lebih dari 1,0.
Uji Implantasi
Uji implantasi dirancang untuk menilai bahan plastic dan polimer lain yang kontak langsung dengan jaringan hidup. Hal yang penting adalah penyiapan strip implantasi dan implantasi secara tepat dengan kondisi aseptik. Siapkan untuk implitasi 8 strip Sampel dan 4 strip Kontrol Negatif BPFI. Setiap strip harus berukuran tidak kurang dari 10 mm x 1 mm. tepi strip harus sehalus mungkin untuk menghindari trauma mekanis tambahan sewaktu implantasi. Strip dengan ukuran minimum tertentu diimplantasi menggunakan jarum hipodermik (ukurann 15 sampai 19) dengan ujung intervena dan trokar steril. Gunakan jarum steril untuk tempat memasukan strip plastic steril secara aseptik, atau masukkan setiap strip bersih kedalam jarum, kanula dan bagian tengahnya dilindungi oleh penutup yang sesuai, dan kemudian lakukan prosedur sterilisasi yang sesuai. [Catatan Bila digunakan etelin oksida, diperlukan jangka waktu yang cukup untuk enghilangkan gas dengan sempurna.]
Hewan Uji Pilih kelinci dewasa sehat dengan bobot tubuh tidak kuarng dari 2,5 kg, dan otot paravertebralnya cukup besar untuk implantasi dengan strip uji. Jangan menggunakan jaringan otot lain selain otot paravertebral. Hewan harus dianestesi dengan bahan anestesi yang biasa digunakan sampai derajat yang cukup dalam untuk mencegah gerakan otot, seperti berkedut.
Prosedur Lakukan uji dalam ruang bersih. Pada hari uji atau hingga 20 jam sebelum uji dilakukan, cukur bulu bagian punggung hewan uji ke dua sisi tulang belakang, bersihkan rambut yang lepas dengan pompa hisap. Seka kulit dengan alkohol encer dan keringkan sebelum disuntik.
Implantasi 4 srtip Sampel kedalam otot paravertebral pada satu sisi tulang belakang masing-masing dari kedua kelinci, 2,5 cm hingga 5 cm dari gelas tengah dan sejajar dengan tulang belakang, dan terpisah lebih kurang 2,5 cm satu sama lain. Dengan cara yang sama implantasi 2 strip Plastik Kontrol Negatif BPFI ke dalam otot paravertebral sisi yang berlawanan dari setiap kelinci. Masukkan stilet steril kedalam jarum untuk menahan strip implan dalam jaringan sewaktu menarik jarum. Bila terjadi pendarahan yang berlebihan setelah implantasi strip, masukkan strip kedua ketempat lain.
Pelihara hewan tersebut selama tidak kurang dari 120 jam, dan korbankan pada akhir waktu pengamatan dengan memberikan dosis berlebih bahan anestesi atu bahan lain yang sesuai. Tunggu beberapa waktu sampai beberapa jaringan dapat dipotong tanpa menimbulkan pendarahan. Periksa secara makroskopik daerah jaringan sekitar bagian tengah dari setiap strip imlan. Gunakan kaca pembesar dan sumber cahaya tambahan. Amati impalntasi Sampel dan Kontrol terhadap terjadinya pendarahan, nekrosis, perubahan warna, dan infeksi kemudian catat hasil pengamatan. Ukur enkapsulasi, bila ada dengan mengukur lebar kapsul (dari tepi rongga yang ditempati implan Kontrol atau Sampel ke bagian tepi kapsul) bulatkan sampai 0,1 mm. Beri skor untuk enkapsulasi sesuai dengan Tabel 6.
Hitung perbedaan antara skor rata-rata Sampel dan Kontrol. Persyaratan dipenuhi bila berbedaan tidak melebihi 1,0, atau bila perbeadaan antara skor rata-rata Sampel dan Kontrol untuk lebih dari satu di antara empat tempat implantasi tidak lebih dari 1 untuk semua hewan yang diimpalntasi.

Uji Iritasi Mata
Uji ini dirancang untuk menilai respons ekstrak bahan uji yang diteteskan kedalam mata kelinci.
Media Ekstraksi Gunakan (1)Injeksi Natrium Klorida (2)Minyak Nabati.
Hewan Uji Pilih kelinci albino sehat dan tidak terlihat adanya iritasi mata dan sebelumnya tidak digunakan untuk uji iritasi mata. Fasilitas hewan harus dirancang dan dipertahankan agar bebas dari serbuk gergaji, serpihan kayu atau bahan lain yang dapat menyebabkan iritasi mata. Periksa kedua mata hewan sebelum dilakukan uji dan gunakan hewan tanpa cacat mata atau iritasi mata. Untuk menguji kesesuaian sistem okuler kelinci yang digunakan untuk suatu sampel tertentu, pilih satu hewan uji dan lakukan seperti tertera pada Prosedur menggunakan 100 l Blangko yang terbuat seperti tertera pada Uji Injeksi Sistemik untuk satu mata dan 100 l air untuk injeksi P untuk mata yang lain. Sistem okuler kelinci sesuai bila tidak ditemukan perbedaan yang signifikasi diantara kedua mata tersebut.
Prosedur Gunakan 3 ekor kelinci albino untuk setiap ekstrak uji. Pegang hewan dengan kuat tetapi lembut sampai hewan tenang. Dengan lembut tarik pelupuk mata bawah dari bola mata sehingga membentuk cawan, dan teteskan lebih kurang 100 l air untuk injeksi P. pegang kedua pelupuk bersama-sama salama kira-kira 30 detik. Teteskan kedalam mata yang lain 100 l ekstrak Sampel yang disiapkan sesuai yang tertera dalam Uji Injeksi Sistemik. Periksa kedua mata setelah 24 jam, 48 jam, dan 72 jam. Beri skor kornea, iris, dan konjungtiva sesuai dengan Tabel 7. Pengamatan dibantu dengan penggunakan lup binokuler dan lampu celah tangan. Persyaratan uji dipenuhi bil ekstrak Sampel tidak menunjukkan respons iritasi positif selama waktu pengamatan dan sistem okuler kelinci wajar seperti yang tertera pada Hewan Uji. Bila iritasi terlihat pada mata Kontrol yang diberi air untuk injeksi P atau bila sistem okuler kelinci terlihat tidak wajar, ulangi uji menggunakan 3 ekor kelinci tambahan. Pada uji ulang semua kelinci harus memenuhi persyaratan uji.


Toksisitas Abnormal
Uji toksisitas abnormal dimaksudkan untuk mendeteksi suatu bahan uji terhadap adanya reaktivitas biologic yang tidak diharapkan dan tidak dapat diterima. Uji in-vivo ini adalah untuk penilaian keamanan sediaan biologi (seperti antitoksin, antibisa, darah, derivate darah, serum kekebalan, alat bantu diagnose imunologik, toksoid, vaksin dan produk sejenis) dan bahan untuk Perangkat Infus dan Transfusi <181>, Tutup Elastomerik untuk Injeksi <721>, dan Wadah <1271>.
Prosedur
Pilih 5 ekor mencit sehat yang belum pernah digunakan untuk pengujian, bobot tubuh antara 17 g dan 23 g, kecuali bila ditentukan lain dalam masing-masing monografi atau di tempat lain bab ini dan pelihara dengan diet seimbangyang cukup. Siapkan larutan uji yang tertera dalam masing-masing monografi. Kecuali bila ditentukan lain dalam masing-masing monografi atau dalam bab ini, suntikkan intravena satu dosis 0,5 ml larutan uji pada masing-masing menct menggunakan jarum ukuran 26 dengan panjang yang sesuai, atau panjang ditentukan di bawah ini. Amati hewan uji selama 48 jam setelh penyuntikan. Bila pada akhir 48 jam, semua hewan tersebut hidup dan tidak lebih dari seekor hewan menunjukkan gejala reaksi yang tidak biasa diharapkan dari derajat toksisitas yang berhubungan dengan bahan tersebut, persyaratan uji ini dipenuhi. Bila satu atau lebih hewan mati atau bila lebih dari seekor hewan menunjukkan tanda toksisitas abnormal atau toksisitas yang tidak diinginkan dari bahan uji, ulangi uji menggunakan paling sedikit 10 ekor mencit lain yang serupa dengan yang digunakan untuk uji awal, tetapi bobot tubuh 20 g+1 g. Bila semua hewan hidup selama 48 jam dan tidak menunjukkan gejala yang menunjukkan indikasi toksisitas abnormal atau toksisitas yang tidak seharusnya dari bahan tersebut, persyaratan uji dipenuhi.
Untuk bahan biologi (seperti antitoksin, antibisa, darah, derivate darah, serum kekebalan, alat bantu diagnose imunologik, toksoid, vaksin dan produk sejenis), lakukan uji mnggunakan tidak kurang dari 2 ekor mencit yang serupa dengan yang diuraikan diatas tetapi dengan bobot tubuh kurang dari 22 g, dan tida kurang dari 2 ekor marmot sehat dengan bobot tubuh kurang dari 400 g. Kecuali bila ditentukan lain dalam masing-masing monografiuntuk sediaan cair atau beku kering yang diencerkan sesuai dengan yang tertera pada etiket, suntikkan 0,5 ml secara intraperitoneal pada setiap mecit, dan 5,0 ml suntikkan secara intraperitoneal pada setiap ekor marmot. Untuk sedian beku kering yang volume konstitusi tidak tertera pada etiket, atau untuk sedian bukan cairan selain sediaan beku kering, lakukan uji menggunakan cara pemberian, dosis uji, dan pengencer yang disetujui oleh instansi yang berwenang, berdasarkan cukup bukti yang menunjukkan bahwa uji ini mempunyai kepekaan yang sama atau lebih besar dari uji yang diuraikan diatas. Amati hewan uji selama waktu pengamatan minimum 7 hari. Bila semua hewan dapat melewati periode uji, tidak menunjukkan respons yang tidak spesifik atau tidak diharapkan dari sediaan tersebut yang mungkin menunjukkan perbedaan kualitas sediaan dan bobot tubuh tidak berkurang pada akhir waktu pengamatan dibanding waktu penyuntikan, persyaratan uji dipenuhi. Bila bahan tersebut tidak memenuhi persyaratan uji, ulangi seperti uji awal, dengan satu atau dua spesies yang digunakan pada uji yang tidak memenuhi persyaratan. Bila hewan memenuhi kriteria yang ditentukan untuk uji awal, bahan tersebut memenuhi persyaratan uji. Bila bahan tersebut tidak memenuhi persyaratan setelah uji ulang pertama, dan tidak kurang dari 50% dari jumlah hewan pada uji awal dan uji ulang pertama, dari spesies yang tidak memenuhi syarat, dapat melewati masa pengamatan, uji ulang kedua dapat dilakukan. Gunakan 2 kali jumlah hewan dari galur yang sesuai yang digunakan pada uji awal. Bila hewan memenuhi kriteria yang ditentukan untuk uji awal, persyaratan uji terpenuhi.